产品信息

1.分子别名
LDH细胞毒性检测试剂盒、LDH Release Assay Kit。

2.产品介绍
细胞毒性（Cytotoxicity）是细胞受到化学物质或其他细胞作用而引起的死亡事件，它是不依赖于凋亡或坏死的细胞死亡。细胞毒性有多种检测方法，其中比较经典的是放射性的⁵¹Cr释放法，而LDH释放是一种更为安全有效的替代方法。LDH可用酶反应来检测，具体原理是：LDH催化乳酸还原为丙酮酸，同时NAD+被还原为NADH，而NADH又可以和INT反应生成红色的甲臜和NAD+，甲臜的量与LDH活性呈正比，利用甲臜在490nm波长处有吸收峰，可以定量LDH的活性。本试剂盒可检测细胞培养液、细胞裂解液等样品中LDH的活性，一个试剂盒可进行1000个样品检测。

3.应用范围
细胞介导的细胞毒性检测、细胞毒性检测、细胞总数检测。

4.产品优势
（1）使用简便，无需提前构建特殊细胞系。
（2）灵敏度高，对早期和低水平细胞毒性均可检测。
（3）反应快，颜色变化明显，反应终点易判断。
（4）试验结果重复性高。
（5）悬浮和贴壁细胞都可使用。

5.产品组分及LDH底物配置
产品组分列表：

       LDH底物溶液的配制：将Solution A, Solution B和Solution C融化，按下表取相应体积配制约5ml底物溶液，颠倒混匀并避光放置。LDH底物溶液现用现配效果最佳，避免反复冻融，检测后剩余底物溶液应尽快放回-30至-10℃保存。各反应液用后应尽快放回-30至-10℃保存。

6.运输
蓝冰运输。

使用方法

1.细胞介导的细胞毒性检测
   1）在圆底96孔板上设置：靶细胞自发对照、靶细胞最大裂解对照、效应细胞自发对  照，以及靶细胞和效应细胞共孵育的试验组。每个对照和试验组可分别设置3个重复孔，每孔终体积相同，终体积可选择100μl或200μl，以下以200μl为例进行说明。
   2）准备适宜浓度的靶细胞和效应悬液，靶细胞和效应细胞离心去除各自原来的培养基，用相同的培养基重悬。
   3）按1）中96孔板设置，依次加入相应溶液（靶细胞自发孔：加入100μl靶细胞，并补充100μl培养基，该孔用于检测靶细胞自发释放LDH；靶细胞最大裂解孔：加入100μl靶细胞，并补充100μl培养基，在收获上清前，加入20μl Lysis solution，37℃孵育45分钟，保证靶细胞完全裂解；效应细胞自发孔：加入100μl效应细胞，并补充100μl培养基，用于排除效应细胞自身释放LDH的干扰。
   4）细胞铺好后，将96孔板200g离心2分钟，保证效应细胞和靶细胞充分接触。
   5）将96孔板转入37℃培养箱孵育（孵育时间由具体实验决定）。
   6）到达预定孵育时间前45分钟，在靶细胞最大裂解孔中加入20μl Lysis solution。
   7）达到孵育时间后，将96孔板200g离心2分钟。
   8）从所有孔中吸取50μl上清，转入新的平底96孔板。
   9）向上清液中加入50μl LDH底物溶液，室温暗处孵育30分钟（培养孔会逐渐变红）。
   10）向每孔加入50μl Stop solution。
   11）用针头扎破气泡，在 490nm波长下检测每孔的吸收值（在加入终止液一小时内完成检测）。
   12）计算杀伤率。杀伤率（%）=【（试验-效应细胞自发-靶细胞自发）/（靶细胞最大裂解-靶细胞自发）】×100。

2.细胞毒性检测
   1）在圆底96孔板上设置对照孔和试验孔，包括：靶细胞最大裂解孔、含靶细胞及测试药物的试验孔、靶细胞自发孔（加入与试验孔等体积的药物溶剂），分别用100μl培养基重悬。
   2）到达预定孵育时间前45分钟，向最大裂解孔加入10μl Lysis solution，37℃反应45分钟。
   3）从所有试验孔和对照孔吸取50μl上清，转入新的平底96孔板。向转移出来的上清中再加入50μl LDH底物溶液，室温暗处孵育30分钟（培养孔会逐渐变红）。
   4）再向每孔加入50μl Stop solution。
   5）用针头扎破气泡，在490nm波长下检测吸收值。
   6）计算杀伤率。杀伤率（%）=【（试验-靶细胞自发）/（靶细胞最大裂解-靶细胞自发）】×100。

3.细胞总数检测
   1）准备一系列数目已知的细胞，及数目待测的细胞，分别用100μl培养基重悬，后转入圆底96孔板，并设置等体积培养基空白对照孔。
   2）向所有孔加入10μl Lysis solution，37℃孵育45分钟。
   3）将96孔板200g离心2分钟，从所有孔吸取50μl上清，转入新的平底96孔板。
   4）向所有上清中加入50μl LDH底物溶液，室温暗处孵育30分钟（培养孔会逐渐变红）。
   5）再向所有孔加入50μl Stop solution。
   6）用针头刺破所有大气泡，即可在490nm波长下检测每孔吸收值。
   7）计算。用所有试验孔吸收值减去培养基空白对照吸收值，即实际吸收值。以细胞数目为X，吸收值为Y，建立Y关于X的线性关系，根据公式，即可计算出相应吸收值对应的细胞数目。

注意事项：

   1）培养基中的酚红和血清都会产生LDH，因此有必要在预实验中检测培养基对照的OD490吸收值。
   2）培养基可以选择无酚红培养基，血清浓度可以降低至1%。
   3）保证实验用细胞处于最佳状态，避免自发过大。
   4）杀伤率比较小时，可以通过延长细胞孵育时间，扩大效应细胞比例等措施改善。
   5）490nm和492nm波长都可用于检测。
   6）吸收值太高，超出酶标仪检测范围时，相应地缩短上清液与LDH底物的反应时间。
   7）悬浮细胞、免疫细胞推荐用圆底96孔板做细胞杀伤试验。