产品信息

1.产品介绍
本产品采用慢病毒三质粒包装系统，转染贴壁293T细胞制备而成，经过浓缩纯化，过滤除菌，可直接用于CAR-T细胞制备。经过多次感染实验验证，本产品可以有效感染分裂期和静止期T细胞，感染效果稳定可靠、重复性高；感染后48小时即可检测到CAR基因表达，且表达长期稳定。

2.CAR基因
本产品的CAR基因结构包含：抗体scFv区、铰链区、跨膜区、共刺激区和激活区，属于二代CAR基因结构。所用的靶向人CD19抗体为鼠源序列FMC63，其它结构均源自天然人源序列，具体结构如下图：

3.制剂
本慢病毒重悬于X-VIVO 15（04-418Q）培养基中，经0.2µm滤器除菌过滤，可直接用于细胞感染。

4.效价
1ml慢病毒液建议感染2.5×10⁶的T细胞；细胞量较大时，等比例增加慢病毒的量即可；为了获得最佳感染效果，请根据特定细胞数量进行优化。

5.运输
干冰运输。

6.存储
-80℃保存；避免反复冻融。

7.应用
制备靶向人CD19 CAR-T细胞。

产品验证
1.活性-FACS

图1. 应用本产品制备的靶向人CD19 CAR-T细胞CAR表达水平约60%。分别取2×10⁵的T细胞和靶向人CD19 CAR-T细胞，用1µl FITC-Labeled Human CD19 Protein进行染色。图左：T细胞，图右：靶向人CD19 CAR-T细胞。

2.活性-Cytotoxicity

    图2. 应用本产品制备的靶向人CD19 CAR-T细胞体外杀伤效果显著。对照T细胞和CD19 CAR-T细胞分别与靶细胞（K562-CD19）共孵育，效应细胞与靶细胞的比例为5：1，用LDH Cytotoxicity Assay Kit（货号：CA22018）检测体外杀伤效果。

使用方法
1.从血液样品中分离单个核细胞（PBMC），并激活T细胞。
2.T细胞激活48小时后，取目标数量T细胞于15ml或50ml离心管中，300g离心5分钟去除上清（注：T细胞激活第二至三天感染效率最佳）。
3.病毒液解冻后，取适量病毒液重悬细胞沉淀，吹打混匀后，2000g离心90分钟。
4.离心结束后，小心去除上层病毒液，用新鲜的细胞培养基重悬沉淀，转入孔板培养 （注：感染后细胞状态略有下降，属正常情况，持续培养几天，即可缓解）。
5.感染48小时后，取2×10⁵个靶向人CD19 CAR-T细胞进行流式实验，检测CAR基因表达情况。

      注意事项：请在二级生物安全柜中进行操作，实验人员应穿戴好实验服、口罩、手套、眼罩等。如不慎发生飞溅等情况，请立即用70%乙醇喷洒病毒污染的地方。

背景
靶向CD19 CAR-T细胞

CD19属于免疫球蛋白（Ig）超家族，是一种跨膜糖蛋白。它是特异性表达于B淋巴细胞各个分化阶段的细胞表面抗原，绝大多数B系来源的恶性肿瘤，包括B细胞急性淋巴细胞白血病（ALL）、慢性淋巴细胞白血病（CLL）和非霍奇金淋巴瘤（NHL）均表达CD19。而在造血干细胞、浆细胞、T细胞及其他组织中，CD19则没有表达。因而，CD19成为了CAR-T细胞治疗中最成功的靶点，目前已有6款以CD19为靶点的CAR-T产品上市，其中国内两款。