产品信息

1.产品介绍
本产品采用慢病毒三质粒包装系统，转染贴壁293T细胞制备而成，经过浓缩纯化，过滤除菌，可直接用于CAR-T细胞制备。经过多次感染实验验证，本产品可以有效感染分裂期和静止期T细胞，感染效果稳定可靠、重复性高；感染后48小时即可检测到CAR基因表达，且表达长期稳定。

2.CAR基因
本产品的CAR基因结构包含：抗体scFv区、铰链区、跨膜区、共刺激区和激活区，属于二代CAR基因结构。所用的靶向人Claudin-18.2抗体scFv为人源序列IMAB362，其它结构均源自天然人源序列，具体结构如下图：

3.制剂
本慢病毒重悬于X-VIVO 15（04-418Q）培养基中，经0.2µm滤器除菌过滤，可直接用于细胞感染。

4.效价
1ml慢病毒液建议感染2.5×10⁶的T细胞；细胞量较大时，等比例增加慢病毒的量即可；为了获得最佳感染效果，请根据特定细胞数量进行优化。

5.运输
干冰运输。

6.存储
-80℃保存；避免反复冻融。

7.应用
制备靶向人Claudin-18.2 CAR-T细胞。

产品验证
1.活性-FACS

图1. 应用本产品制备的靶向人Claudin-18.2 CAR-T细胞CAR阳性率接近50%。分别取2×10⁵的T细胞和靶向Cludin-18.2 CAR-T细胞，用5µl Fluorescent Human Claudin-18.2 VLP（货号：CA22002）进行染色。图左：T细胞，图右：靶向Cludin-18.2 CAR-T细胞。

2.活性-Cytotoxicity

图2. 应用本产品制备的靶向人Claudin-18.2 CAR-T细胞体外杀伤效果显著。对照T细胞和Claudin-18.2 CAR-T细胞分别与靶细胞（293T, 293T Claudin-18.2）共孵育，效应细胞与靶细胞的比例为5：1，用乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性检测试剂，检测体外杀伤效果。

使用方法
1.从血液样品中分离单个核细胞（PBMC），并激活T细胞。
2.T细胞激活48小时后，取目标数量T细胞于15ml或50ml离心管中，300g离心5分钟去除上清（注：T细胞激活第二至三天感染效率最佳）。
3.病毒液解冻后，取适量病毒液重悬细胞沉淀，吹打混匀后，2000g离心90分钟。
4.离心结束后，小心去除上层病毒液，用新鲜的细胞培养基重悬沉淀，转入孔板培养 （注：感染后细胞状态略有下降，属正常情况，持续培养几天，即可缓解）。
5.感染48小时后，取2×10⁵个靶向人Claudin-18.2 CAR-T细胞进行流式实验，检测CAR基因表达情况。

注意事项：请在二级生物安全柜中进行操作，实验人员应穿戴好实验服、口罩、手套、眼罩等。如不慎发生飞溅等情况，请立即用70%乙醇喷洒病毒污染的地方。

背景
靶向Claudin-18.2 CAR-T细胞
Claudin是正常组织紧密连接蛋白，具有4个跨膜结构域，其家族包含至少24个成员，其中Claudin-18有Claudin-18.1和Claudin-18.2两种异构体。Claudin-18.2表达严格限于胃粘膜上已分化的上皮细胞中，在胃食管癌、肺癌和其他实体瘤中通常过度表达，在胃癌有70%-80%的表达，在胰腺癌有60%表达，在结直肠癌、卵巢癌也有表达，是实体瘤免疫治疗的有效靶标。靶向Claudin-18.2 CAR-T已经在复发难治性胃癌/胰腺癌中取得突破性疗效，现有数据显示，其客观缓解率超过50%。